摘要 [目的]探讨低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖肝脏中溶茵酶基因表达的影响。

[方法]利用CODEHOP设计简并引物，通过RT．PCR克隆中华鳖溶菌酶基因，然后通过半定量PCR分析低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶基因在肝脏中表达量的影响。

[结果]通过克隆中华鳖溶茵酶基因，获得300bp的溶菌酶基因片段，其GenBank登录号HQ437284，与GenBank登录号Q7LZQ1.3的中华鳖c型溶菌酶氨基酸序列同源性为75％。半定量分析结果表明，低聚异麦芽糖可显著提高中华鳖溶菌酶基因在肝脏中的表达量，而酵母细胞壁对中华鳖溶茵酶基因片段在肝脏中的表达量的影响不显著。[结论]该研究可为低聚异麦芽糖和酵母细胞壁在中华鳖养殖中的科学应用以及绿色环保添加剂的开发提供理论依据。

关键词

中华鳖；溶萄酶；基因表达；低聚异麦芽糖；酵母细胞壁

    中华鳖(Trionyx sinensis)隶属于龟鳖目、鳖科、鳖属，营养丰富，味道鲜美，自古以来就是人们喜爱的名贵水产品。由于国内外市场需求的不断增加，使得近年来鳖养殖业迅猛

发展。但是由于鳖的高密度养殖，高蛋白饵料投喂造成了水环境的恶化，传染病日趋严重。由于抗生素治疗的负面效应较为严重，学者们开始寻找防治该病的新方法，而免疫添加剂的研究就是其中热点之一。

    溶菌酶(Lysozyme，LSZ)是一种作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶，具有抗菌等功效，是动物免疫系统中重要的非特异性免疫因子，因此常被作为评价免疫增强剂增强机体免疫水平的重要指标之一。目前，国内对免疫添加剂提高溶菌酶活性方面已有较多报道，但有关溶菌酶基因组织表达量的报道较少。水生动物溶菌酶的研究虽起步较晚，但近年来也取得了可喜的进展，世界各地的学者相继从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、牙鲆(Paralichthys oliva-ceus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和斑节对虾(Penaeus monodon)等水生动物中克隆到了溶菌酶基因。然而目前却未见有关中华鳖溶菌酶基因克隆的报道。因此，笔者利用CODEHOP设计的简并引物通过RT·PCR克隆了中华鳖溶菌酶的基因片段并研究了低聚异麦芽糖和酵母细胞基金项目壁对中华鳖溶菌酶基因在肝脏中表达的影响，以期丰富中华鳖免疫添加剂的研究资料。

1材料与方法

1.1实验动物与添加剂

中华鳖购自杭州周浦水产供销社，选择温室养殖的体重基本一致的稚鳖500只，平均体重(67．80±8．19)g。低聚异麦芽糖，购自上海西宝生物有限公司，含量在98％以上；酵母细胞壁，由武汉安琪酵母股份公司惠赠。基础饲料选用中华鳖稚鳖料，基本组分见表1。

1.2试验设计与饲养条件

暂养15 d后，选取350只健康鳖在温室内进行试验。将鳖随机分成5组，每组设2个重复，共用10个养殖池(2.0m×4.0m×0.3m)，每个池放养鳖35只并设饵料台1个，整个试验期为45 d。其中，CK组只投喂基础饲料，G组在基础饲料中添加0.1％酵母细胞壁，M组在基础饲料中添加0.3％低聚异麦芽糖，(G+M)组在基础饲料中添加0.1％酵母细胞壁和0.3％低聚异麦芽糖，连续投喂整个饲养周期，(G-M)组以9 d为1个循环周期，交替投喂添加0.1％酵母细胞壁和0.3％低聚异麦芽糖的饲料和基础饲料，投喂前按1：l的重量比向试验饲料加水，人工揉成饼状。投喂时将饼状饲料固定在投料台上。日投饵量按中华鳖体重的3％投喂。饲养期间水体泼洒消毒剂消毒2次，预防疾病的发生。养殖期问水体溶解氧(DO)>1.2 mg/L，硝酸氯（NH3）<2 mg/L，pH 7—9，水温(30±2)℃。

1.3引物设计

    从NCBI数据库中检索与中华鳖分类地位相近物种的溶菌酶基因氨基酸序列并分析其保守序列，登录CODEHOP引物在线设计网站,设定检索参数为简并度64，退火温度60℃，遗传密码standard，密码子选用框turtle，得到以下筒并性上游和下游引物：上游引物5’-TTCCCTGG—GAGATTGGGTNTGYRC-3’；下游引物5’-CACTGGGACACATCTTTTCCTTTRCARTWYTT-3’；内参基因选择看家基因β—actin：上游引物5’-CGGGACCTGACTGACTACCTC-3’；下游引物5'-GGACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’；所有引物合成均由上海英骏生物技术有限公司完成．

1.4 RT-PCR

    RNA的抽提参照RNA提取试剂盒说明书进行，第1链cDNA的合成参照PrimeScfiptII 1st Strand cD—NA Synthesis Kit(TaKaRa)试剂盒说明书进行，反应体系共20ul，按下列条件进行反转录：42℃ 60min，95℃ 5min。反应结束后将其放在冰上备用或一20℃保存。

    以合成的第1链cDNA为模板进行PCR反应。反应体系为10×PCR buffer 2ul，dNTPmixl.6ul，Taq砷酶0.1ul，模板1ul，上、下游引物各0.4ul，灭菌水补足到20ul。然后按以下参数进行PCR反应：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30s；共30个循环；最后72℃延伸10min。取PCR产物lOul，加入2ul上样缓冲液，在1.2％琼脂糖凝腔中稳压l00V电泳20min，电泳完毕后使用凝胶成像分析系统拍照并进行分析。

    扩增结果在1％琼脂糖凝胶上电泳，将获得的目的片断进行纯化、回收，转化后挑取阳性克隆，酶切鉴定后挑选信号较好的克隆送交上海英骏生物技术有限公司测序。测序后将得到的片段序列登录NCBI网站进行blastx验证和检索GenBank数据库进行同源性比对。

1.5目的片段组织表达的半定量分析

    采用半定量PER，检测低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖溶苗酶基因在肝脏中的表达情况。在养殖周期结束后，采集各组中华鳖的肝脏(每组2个平行，每个平行取样本5个并剪成小块，浸泡于RNAfixer无液氮型样品RNA保存液中，置于一20℃中可长期保存。RNA抽提、反转录、扩增等操作后将所得RT-PCR产物进行电泳并进行灰度扫描，得到目的片段与内参之间的灰度比，即半定量分析结果。

1．6血清制备以及溶苗酶活性的测定

    采用断头取血法采血，在室温下放置2—4 h，待血凝固收缩后，再转人4℃的冰箱中，静置过夜．使血块进一步收缩和析出血清。然后以5 000r/min转速在4℃下离心5 min，收集上清液即为血清，-20℃保存备用。

    溶菌酶活性的测定采用南京建成生物工程研究所的溶菌酶测定试剂盒(比浊法),操作方法参照试剂盒说明书进行，溶菌酶含量以ug/ml表示。

1．7数据处理

    采用Excel 2003和SPSS 13.0软件进行方差分析(One-way ANOVA)与LSD多重比较．数据均以平均值±标准差表示。

2结果与分析

2.1 中华鳖溶菌酶基因的克隆

2.1.1  RT-PCR电泳结果。因样品RNA未用液氮保存，而用RNAfixer保存，故用紫外分光光度计检测所提取样品总RNA质量。样品A260-280介于1.8～2.0，琼脂糖凝腔电泳图谱中28S和18S条带明亮、清晰(图1)，说明RNA质量较好，可用于后续试验。

以中华鳖肝脏和肾脏总RNA反转录产物为模板，RT—PCR扩增得到目的片段。从图2可以看出，目的基因片段特异性条带出现在300 bp附近，与预期目的片段大小(355 bp)大致相符，内参基因β-aclin的特异性条带为549 bp。

2.1.2  序列分析以及同源性比较。RT-PCR产物经电泳、回收、纯化、测序得到303 bp溶菌酶基因序列片段．核苷酸序列和相应的氨基酸序列结果见图3。该核酸序列在NCBI网站上的注册号为HQ437284。

      克隆的中华鳘溶菌酶基因cDNA片段所编码的氨基酸序列与C型溶菌酶有较高相似性．与GenBank登录号Q7LZQl.3的中华鳖C型溶菌酶氨基酸序列一致性最高达75％，与GenBank登录号P85345.1的亚洲巨鳖(Amyda carti—laginea)C型溶菌酶氨基酸序列一致性为7l％，与GenBank登录号P84492.1的绿螭龟(Chelonia mydas)C型溶菌酶氨基酸序列一致性为71％。

2.2中华鳖肝脏中溶菌酶基因表达的半定量分析

      分别将中华鳘溶菌酶基因片段与β-actin基因片段RT-PCR扩增产物进行电泳，以凝胶成像系统扫描灰度，溶菌酶基因片段肝脏中的表达量以溶菌酶基因片段与β-actin基因片段灰度比表示，半定量分析结果见图4。

CK组、G组、M组、(G+M)组和(G—M)组肝脏中基因片段灰度比见图4。显著性检验结果表明，各基因片段灰度比组间差异显著(P<0.05)，LSD多重比较分析结果表明CK组、G组和(G+M)组以及(G—M)组间差异不显著(P>O.05)，然而M组和CK组(P=0．004)，G组(P=0．008)以及(G—M)组(P=0.016)间差异显著(P<0.05)，但与(G+M)组差异不显著(P>0.05)。

  同时，试验中也检测了血液中溶菌酶的活性(图4)。ANOVA检验表明，不同处理组溶菌酶活性差异显著(P<0.05)，LSD多重比较分析结果表明CK组、G组和M组以及(G—M)组之间差异不显著(P>0.05)，但(G+M)组溶菌酶活性显著高于CK组、G组、M组以及(G-M)组(P<0.05)。

3讨论

 CODEHOP简并引物的3’端为核心简并区，5’端为非简并性夹板结构。5’端夹板结构是根据密码子偏向性设计的一致性序列，它最大程度地预测了保守性氨基酸的编码序列，既减少了引物的简并度，又保证了PCR产物的特异性，对于克隆未知基因家族片断是非常有效的[6-7]。目前，学者们相继在鱼、虾上克隆出了溶菌酶基因[2-5]，但与中华鳖分类地位相近的水生动物中却未见有关报道。该试验利用CODEHOP引物设计程序，从NCBI网站数据库中检索与中华鳖分类地位相近物种的溶菌酶基因氨基酸序列并分析其保守序列，设计了1对CODEHOP筒并引物，通过RT-PCR克隆到了中华鳖溶菌酶基因，得到大小为303 bp的片段，通过blastx比对，证实该基因片段编码中华鳖C型溶菌酶部分氨基酸序列。CODEHOP引物由于长度大于一般引物，较易产生引物二聚体[8-9]，因此进行RT—PCR扩增时宜采用热启动来减少引物二聚体产生的量，其次对用CODEHOP设计的简并引物，应用Oligo等软件精确算出或预试验得出退火温度和循环数等参数。该试验以看家基因β-actin为内参，通过灰度比半定量地分析了低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶基因片段在肝脏中表达的影响。从该研究结果来看，低聚异麦芽糖对中华鳖溶菌酶基因片段在肝脏中的表达量具有显著的影响，饲料中单独添加低聚异麦芽糖的投喂组(M组)的中华鳖溶菌酶基因片段的表达量都显著高于其他组(P<0.05)，仅与饲料中联合添加低聚异麦芽糖和酵母细胞壁的(G+M)组无显著差异(P>0.05)，而酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶基因片段组织的表达量无显著影响。

      Wang等[10] 在研究凡纳滨对虾时指出当葡聚糖添加量达到0．2％以上时，虾血细胞中溶菌酶mRNA表达水平显著提高，但24 h以后逐渐降低，表明葡聚糖对凡纳对虾溶菌酶mRNA的表达有一定的时间效应和剂量效应。孙永欣等和汤菊芬等刮在研究黄芪多糖对仿刺参(Apostichopuz japoni-cus）和吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)溶菌酶mRNA表达时也发现有类似现象。该试验中酵母多糖对中华鳖肝脏溶菌酶mRNA表达无显著影响(P>0.05)，是否是由于取样时间错过了酵母细胞壁的时间效应期而无法检测到溶菌酶mRNA的表达，还不清楚。酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶mR-NA的表达也可能存在剂量效应，尽管在试验中发现饲料中添加0.1％水平的酵母细胞壁对血液中溶菌酶活性也无显著影响(P>0.05)，这与季高华等的研究结果类似，而汪成竹等研究表明当添加量达到每千克鳖质量添加1 000mg水平时对血液中溶菌酶活性有显著提高，而对于溶菌酶mR-NA表达是否由于添加剂量小而无法促进溶菌酶mRNA的表达，还有待研究。

       目前，未见低聚异麦芽糖对中华鳖溶菌酶mRNA表达研究的类似报道，但何四旺等研究表明饲料中添加0.2％或0.6％的低聚异麦芽糖可以显著提高奥尼罗非鱼血液中溶菌酶的活性，该试验中饲料单独添加低聚异麦芽糖的投喂组(M组)中华鳖溶菌酶活性未显著高于对照组(P>0.05)，但联合添加低聚异麦芽糖和酵母细胞壁的投喂组(G+M组)显著高于对照组与其他试验组(P<0．05)，而在检测中华鳖溶菌酶mRNA表达时饲料中单独添加低聚异麦芽糖的投喂组(M组)的基因片段的表达量却显著高于其他试验组(P<0.05)。Smith等研究表明，外源微生物的胞壁成分可以引起动物细胞的溶解和内容物的释放，从而提高血液免疫指标，但就其能否有效保护动物避免感染的问题提出了谨慎的观点并发现葡聚糖等免疫促进剂具有细胞毒性。至于中华鳖是否有类似的现象，目前还不清楚，但可推测低聚异麦芽糖促进了中华鳖溶菌酶基因片段在肝脏中的mRNA表达，而酵母细胞壁则促进了肝组织细胞中溶菌酶的释放，血液中比活力升高。