摘要：为了获得安全酵母饲料生产的工艺参数，该研究通过单因素试验和正交试验考察了酵母茵接种质量分数、含水率、葡萄糖添加质量分数、尿素添加质量分数、产品干燥温度等因素对高蛋白和低蛋白配方培养基生产的酵母饲料的质量影响，并利用气相色谱一质谱联用检测成品的三聚氰胺质量分数。研究确定安全酵母饲料的生产工艺为：酵母茵接种质量分数为2％，含水率为65％左右，葡萄糖添加质量分数为4％(湿基)，在30℃下发酵48 h，在70℃下干燥1 h，所得最终产品的酵母茵总数可达到42亿/g左右，含水率小于9％，活菌率为70％左右，三聚氰胺的质量分数为0．18～0．403 mg/kg。通过该工艺参数下生产的酵母饲料(培养基蛋白的质量分数为22％一285％，尿素添加质量分数为l％～l0％)是符合质量标准要求的，但低蛋白配方培养基生产的酵母饲料的三聚氰胺质量分数较高，即潜在安全风险较高。

关键词：工艺；参数评估；酵母；饲料；安全

    酵母饲料的生产在中国已有10多年的历史，以其丰富的B族维生素、较合理的氨基酸组成，富含活性消化物质及未知生长因子而在饲料行业中占有较重要的地位，更以其较低的价格及可以部分代替鱼粉而受到饲料生产厂家及广大养殖户的青睐。酵母饲料的生产原料多以大豆粕(饼)、菜粕等本身含有较高植物蛋白的原料为基料，通过几种酵母菌的协同作用，使植物蛋白转化为酵母菌体蛋白，使原料中的町溶性含氮化合物转化为酵母菌体的成分，因而提高酵母菌总数。

    中国对酵母饲料的研究都是集中在酵母的生长条件、酵母在饲料中的应用同、酵母培养物的作用、酵母蛋白代替鱼粉对动物生产性能的影响等，人们比较关注原料经过发酵后蛋白的增加量。但目前饲料中已经检测出三聚氰胺，酵母饲料也不例外，三聚氰胺到底是什么原因产生的尚不明确，也没有相关的研究报道。

    本试验研究高蛋白和低蛋白2种培养基生产酵母饲料的工艺，在保证产品质量的前提下，检测在培养基中添加过量的尿素经发酵、干燥后生产的产品的安全性以及产品的{聚氰胺质量分数，为农业部制定饲料中三聚氰胺限量标准提供参考。

1材料与方法

1．1试验材料弓设备

1．1．1试验材料

    菌种是由丹它利公司提供的酿酒酵母(Saccha-romycescerevisiae)。

    豆粕由秦皇岛金海粮油集团提供；DDGS(dis-tⅢers拍edgrains withsolubles酒糟蛋白饲料)由承德避暑山庄饲料有限公司提供；苹果渣由青岛加宏进口有限公司提供；麸皮、酒糟、喷浆玉米皮由天津彩虹饲料有限公司提供。

1．1．2主要仪器没备

    L—RH一250生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司生产)；DHG一9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司生产)；XSZ—G生物显微镜(重庆光电仪器有限公司生产)；电子天平(梅特勒一托利多仪器有限公司生产)；7890A气相色谱仪和5973C质谱仪(美国Agilent公司生产)等。

1．2式验方法

1．2．1酵母饲料的生产T艺

    酵母饲料生产的一般工艺流程见图l。

    本试验采用高蛋白(配方1)和低蛋白(配方2)培养基配方，研究其获得安全酵母饲料的生产工艺。同时在培养荩中添加过量的非蛋白氮，如硫酸铵、尿素等，它们经微，仁物发酵后可以转化为蛋白，在一定程度上提高了饲料蛋f{质的质量分数，但也可能会衍生三聚氰胺，使酵母饲料危害动物及人类的健康。本试验检测了最终成品的三聚氰胺质量分数。酵母饲料归类于蛋白饲料原料，在保证培养基配方中蛋白质的质量分数大于20％的前提下。设计培养基配方如下(质量比)：

    培养基配方1：豆粕：喷浆玉米皮：酒糟：麸皮=3：8：8：1。

    培养基配方2：弓粕：喷浆玉米皮：DDGS(Dis-tⅢers Dried Gmins with Solubles酒糟蛋白饲料)：苹果渣：麸皮=1：8：3：7：1。

    按培养基配方取40 g原料灭菌后，加入约1：1的煮沸后晾凉的水，接种适量的酵母菌，然后加入适量营养盐在30℃条件下发酵115J，其中尿素添加质量分数为3％，磷酸二氢钾添加质量分数为0．05％，硫酸镁添加质量分数为0．15％，磷酸钙添加质量分数为0．2％(湿基)。

    可粕在酵母生长过程中提供氮源，是不可缺少的。因此，在酵母饲料的生产过程中一定要添加适量的氮源，酵母菌才能生长。在配料中加入大量的麸皮等底物，一方面能为酵母菌繁殖提供充足的碳源，同时也可使固态发酵物具有良好的通透性，为酵母菌繁殖提供充足的氧气。

1．2．2测定指标及方法

    酵母菌总数及其活率测定：参照DB6l/T210—2005方法测定。

    三聚氰胺测定：饲料中三聚氰胺的测定根据NY/T1372—2007方法测定，采用气相色谱一质谱联用方法(gas chromatography一mass spectrometry)。

1．3试验设计

1．3．1发酵过程的单因素试验设计

    只针对高蛋白配方(配方1)进行单因素和正交试验，获得的参数用于低蛋白配方(配方2)验证其酵母菌总数是否可以达到要求。

1．3．1．1 酵母接种质量分数的影响

    酵母接种质量分数会影响酵母菌总数，在培养基含水率为60％，葡萄糖添加质量分数为3％的条件下，控制酵母添加质量分数(湿基)1％、2％、3％、4％、5％，检测发酵24、48、60、72 h的酵母菌总数。

1．3．1．2培养基含水率的影响

    在固定酵母菌接种质量分数为湿重2％，葡萄糖添加质量分数为3％的条件下，控制培养基含水率在50％、55％、60％、65％、70％。检测发酵24、48、60、72 h时的酵母菌总数。

1．3．1．3 葡萄糖添加质量分数的影响

    在固定酵母菌接种质量分数为湿重2％，培养基含水率在60％的条件下，控制葡萄糖的添加接种质量分数分别为l％、2％、3％、4％、5％，检测发酵24、48、60、72h时的酵母菌总数。

1．3．2 发酵过程影响因素的正交试验设计

针对高蛋白配方(配方1)根据单因素试验结果，选择合适酵母菌接种质量分数(A)，培养基含水率(B)和葡萄糖添加质量分数(C)并采用L9(34)正交表进行了三因素三水平正交组合试验，见表l。

1．3．3干燥温度比较试验

    将2种培养基获得的产品分别干燥，采用低温长时和高温短时2种方法，在试验中采用70℃和100℃干燥，以成品含水率≤9％为目标确定干燥相应的干燥时间，以活菌率为选取目标，筛选出合适的干燥方法。

1．3．4尿素添加质量分数对产品三聚氰胺质量分数的影响

    在2种培养基中分别添加质量分数为1％、3％、5％、7％、10％的尿素，通过发酵干燥试验后，采用GC-MS法测定每个配方中对应不同的尿素添加质量分数的产品的三聚氰胺质量分数。

2结果与分析

2．1单因素试验

2．1．1接种质量分数对酵母菌总数的影响

    发酵最佳时间点是指发酵物味道香醇、代谢产物积累最多的点。

    由图2a可知，酵母菌接种质量分数较大时酵母菌总数达到最大值时的发酵时间比较短，接种质量分数为小于等于3％在48 h酵母菌总数达到最大值，之后下降，这时表明菌体开始自溶，而接种质量分数大于等于4％时在36 h酵母菌总数就达到最大值。由图2b可知。随着接种质量分数的增加酵母菌总数并没有增加多少，这可能是因为底物有限，不适合更多的酵母菌繁殖生长。

因此，在保证一定酵母菌总数和降低配方成本的前提下，可以控制接种质量分数为2％，发酵时间为48 h。

注：a．不同接种质量分数对发酵时间和酵母菌总数的影响．b．发酵48 h不同接种质量分

    数对酵母菌总数的影响；培养基含水率60％。葡萄糖添加质母分数3％。

    图2接种质量分数对发酵最佳时间和酵母茵总数的影响

2．1．2培养基含水率对酵母菌总数的影响

    在固定酵母菌的接种质量分数为2％，葡萄糖的添加质量分数为3％的条件下，培养基含水率对发酵时间和酵母菌总数的影响如图3所示。

    由图3a可知，在酵母菌发酵的过程中，酵母菌总数随着时间的增加先增加后减少，开始时酵母菌繁殖增加，在48 h时达到最大值，之后开始自溶，酵母菌总数下降。

由图3b可知，在酵母菌的整个发酵过程中，在48 h时以培养基含水率50％为起点，随着培养基含水率的增加酵母菌总数先增加后减少。在培养基含水率为65％时达到最大值。

因此，在保证一定酵母菌总数前提下，控制培养基含水率为65％，发酵时间为48h。

注：a．不同培养基含水率对发酵时间和酵母菌总数的影响．b．发酵48 h不同培养基含水

    率对酵母菌总数的影响；酵母菌接种质量分数2％，葡萄糖添加质量分数3％。

    图3培养基含水率对发酵最佳时间和酵母菌总数的影响

2．1．3葡萄糖添加质量分数对酵母菌总数的影响

在固定培养基含水率为65％，酵母菌接种质量分数为2％的条件下，不同葡萄糖添加质量分数对发酵时间和酵母菌总数的影响如图4所示。由图4a可知，在酵母菌发酵的过程中，酵母菌总数随着时间的增加先增加后减少，开始时酵母菌繁殖增加，在48 h时达到最大值，之后开始自溶，酵母菌总数下降。

    由图4b可知，发酵48 h，随着葡萄糖添加质量分数的增加，酵母菌总数先增加后平稳，当葡萄糖的添加质量分数小于4％时，酵母菌总数随着添加质量分数的增加而增加，这可能是因为碳源不足造成的，在碳源充足或过多的条件下，酵母菌总数不再增加甚至减少。

因此，在保证一定酵母菌总数前提下，葡萄糖添加质量分数为4％，发酵时间为48 h。

2．2正交试验(见表2)

由表2可知，通过极差分析得m影响酵母菌总数的3个因素的主次顺序依次为B、A、C，即培养基含水率、接种质量分数、葡萄糖添加质量分数。

注：a．乱不同葡萄糖添加质量分数对发酵时间和酵母菌总数的影响；

b．发酵48 h不同葡萄糖添加质量分数对酵母菌总数的影响：酵母菌接种质量分数2％．培养基含水率60％。

图4葡萄糖添加质量分数对发酵时问和酵母菌总数的影响

    试验所得酵母菌总数的较佳优化参数为A2B2C2：，即接种质量分数为2％，培养基含水率为65％，葡萄糖添加质量分数为4％。以较优组合进行验证试验，配方l得到酵母菌总数为42．5亿/g。然后将获得的参数即接种质量分数为2％，培养基含水率为65％，葡萄糖添加质量分数为4％应用于配方2中，成品的酵母菌总数可达42亿/g，符合酵母饲料酵母菌总数的要求，证明此工艺是可取的。

2．3干燥温度试验

    在70℃和100℃条件下干燥，当成品含水率为9％时，相应的干燥时间为1 h和45 min。在100℃干燥45 min的条件下配方l的活菌率为41％，配方2的活菌率为38％，在70℃干燥l h的条件下配方l的活菌率为70％，配方2的活菌率为72％。可见采用100℃干燥时酵母菌的活菌率较低，这_口r能是因为酵母本身不耐高温，在100℃时死亡率较高，为了确保成品的活菌率，采用70℃干燥l h。

2．4尿素添加质量分数试验(见图5)

    由图5可知，试验发现最终产品的三聚氰胺质量分数的范围为O．18—0．403 mg/kg，在尿素添加质量分数为l％～7％时，配方2的三聚氰胺质量分数较高，说明低蛋白配方生产的酵母饲料的潜在安全风险高于高蛋白配方生产的酵母饲料。

3结论

3．1在30℃条件下发酵试验中发现，酵母菌接种质量分数、培养基含水率、葡萄糖添加质量分数都对酵母菌总数有影响，当接种质量分数为2％，培养基含水率为65％，葡萄糖添加质量分数为4％时，发酵48 h，两种培养基获得的酵母饲料中酵母菌总数可达到约42亿/g，符合酵母饲料的要求。

3．2在干燥试验中，采用低温长时干燥法，2种培养基配方获得的酵母饲料的活菌率较高，如采用70℃干燥1 h，饲料含水率小于9％，活菌率达到70％左右。

3．3通过对2种培养基生产酵母饲料工艺的研究发现，低蛋白配方培养基生产的酵母饲料的三聚氰胺质量分数较高，即配方2生产的酵母饲料的安全风险高于配方l生产的酵母饲料。

    今后要针对低蛋白配方培养基(蛋白质的质量分数低于22％)生产的发酵饲料的工艺参数进行进一步研究，控制其质量安全。